4-氨基-1-萘酚类ABL和AKT1蛋白激酶抑制剂的设计、合成和初步活性研究
【摘要】目的：异常的血管生成,包括内皮细胞激活、降解基底膜、内皮细胞的定向运动和增殖、新生微血管、内皮细胞新的基底膜合成、血管腔产生、芽式生长并形成血管襟等一系列步骤,是肿瘤细胞增殖,侵袭和转移的先决条件。Abl和Akt(proteinkinaseB,PKB)蛋白激酶是肿瘤细胞和血管内皮细胞内两个重要的信号通路节点,他们可以通过磷酸化下游底物来调节肿瘤细胞和内皮细胞内许多重要的生理过程,包括细胞存活、增殖、迁移和血管生成等。蛋白激酶抑制剂根据作用于激酶结合位点的不同分为三种：作用于ATP结合位点的蛋白激酶抑制剂,作用于调节区的蛋白激酶抑制剂和蛋白激酶底物竞争性变构抑制剂。近几年,多种靶向于蛋白激酶的药物如Sunitinib、Sorafenib、Pazopanib等被成功推向了市场用于各种肿瘤的治疗。尽管这些肿瘤血管生成抑制剂有着很大的优势,但是实际应用仍存在部分肿瘤对血管的新生依赖性不强、突变及肿瘤信号传导的代偿性导致的耐药、不良反应和毒性等问题。因此进一步开发选择性更强、活性更高且毒性更小的小分子蛋白激酶抑制剂仍然非常必要。随着对Bcr-Ab1和Akt相关信号通路研究的不断深入,Bcr-Abl和／或Akt抑制剂的研究已经成为抗肿瘤药物研究的热点。方法：本研究首先在计算机虚拟筛选的过程中发现了具有明显抗血管生成作用的化合物Hit6a。后期的酶谱筛选工作表明,6a可以选择性的抑制Abl和Akt1两个激酶,靶点非常明确。之后我们设计合成了五个系列基于4-氨基-1-萘酚骨架的6a类似物,并进行了体外抗肿瘤细胞增殖、抗血管生成和蛋白激酶抑制活性研究,一方面对这一类结构骨架化合物进行构效关系(SAR)研究,另一方面也希望获得比Hit6a的抗肿瘤和抗血管生成活性更好的先导结构。结果：本研究共设计、合成了五个系列81个基于4-氨基-1-萘酚骨架的Hit6a类似物,并对所合成的目标化合物通过电喷雾质谱以及核磁共振氢谱等方法进行了结构确证,经查阅文献证实,除个别化合物外所合成的目标化合物均为新型化合物,未见文献报道。我们对合成的化合物进行了体外抗肿瘤细胞增殖活性、体外抗血管生成活性和抑酶活性研究。实验结果表明,合成的4-氨基-1-萘酚类化合物在抑酶活性研究中表现出的构效关系规律与在体外抗肿瘤细胞增殖和体外抗血管生成活性研究中表现出的构效关系规律具有高度的一致性,而且化合物的抗血管生成活性与抑制VEGF/VEGFR无关,这给我们这样的提示,即合成的4-氨基-1-萘酚类化合物是通过抑制Abl和Aktl蛋白激酶的活性来实现其抗肿瘤细胞增殖和抗血管生成活性的。构效关系研究表明,Hit6a的萘酚环(Figure5-1,a部分)可以通过疏水作用或者π-π堆积作用与激酶活性位点的疏水性口袋的结合,将萘环变为较小的苯环后(D系列)会导致化合物与受体的结合力下降,抑酶活性和抗血管活性明显下降,抗肿瘤细胞增殖活性几乎丧失；而在萘环的6,7位引入两个甲氧基基团后(E系列),将增强化合物的疏水性,增强与受体结合能力,进而化合物的抑酶活性、抗血管活性和抗肿瘤细胞增殖活性明显增强。而在7位保持甲氧基不变,6位引入丙基吗啉侧链(33a)时,一方面提高了化合物水溶性,另一方面通过氢键作用增强了化合物与受体的结合力,使化合物能够充分的占据结合口袋的空腔区域,提高了化合物的抑酶活性,抗血管活性和抗肿瘤细胞增殖活性。Hit6a的三氮唑五元芳杂环(Figure5-1,b部分)可以伸向Abl和Aktl激酶的DFGmotif,并与DGFin构象(蛋白处于活化状态时的构象)的氨基酸ASP形成氢键作用；当其被5-甲基-1,3,4-噻二唑、1,3,4-噻二唑或者1-甲基-四氮唑环替代后氢键作用消失,同时引起化合物分子在受体结合口袋中结合位置和构象的改变,导致抑酶活性急剧降低,抗血管活性和抗肿瘤细胞增殖活性大大减弱；而当三氮唑五元芳杂环被嘌呤环替换(B系列)后,引起化合物分子在受体结合口袋中结合位置和构象的改变,但是嘌呤环可以与结合口袋中的其他位置氨基酸形成氢键作用,最终抑酶活性稍有降低,抗血管活性和抗肿瘤细胞增殖活性稍有减弱。需要注意的是三氮唑五元杂环被嘌呤环替换后,化合物(比如9n)对激酶选择的特异性会下降,而这并不是我们所期望的。Hit6a的磺酰胺基-SO2NH-(Figure5-1,c部分)可以与Ab1和Akt1激酶活性口袋内铰链区、G-loop或者P-loop区域氨基酸残基形成氢键作用,提高化合物与激酶的结合力,同时该基团可以使化合物保持在一个易于与活性口袋结合的构象；而用-CONH-基团替代后,氢键作用消失,化合物的空间构象也不利于与活性口袋结合(比较Figure4-1中的9d和13q),导致抑酶活性大大降低甚至消失,抗血管活性和抗肿瘤细胞增殖活性大大减弱。Hit6a的R位置2-萘基(Figure5-1,d部分)可以与Abl和Aktl激酶活性口袋内铰链区,该位置不同的芳香基(R)基团对化合物的激酶抑制活性的影响呈现出了一定的规律性。(a)R基团为苯基时要比为较大的基团(如萘基,喹啉基,4-叔丁基苯基和4-(1,1’-联苯)基)或者较长(苯乙烯基)的基团时活性好(13a和13bvs13c和13d,9f和9pvs9a和9g)。(b)R基团为苯基时,苯环上连接吸电子基团(13d/13c的-NO2/-Cl)的化合物要比连接推电子基团的的化合物(13e/13i的-OMe/-Me)活性好。(c)R基团上为双取代基时化合物的抑制活性要比单取代时的抑制活性要好(9e,9k,9nvs9j,9d,9b).基于以上构效关系研究结果,在E系列抑制剂设计中,我们保存了化合物中间骨架萘酚环,磺酰胺基团和三氮唑五元杂环,同时在萘环的6,7位引入两个甲氧基基团,甲氧基的引入能够进一步增强萘酚片段的疏水作用,从而提高对Abl和Akt1激酶的抑制活性,提高其选择性。该系列化合物26a-26g的体外抑酶活性明显好于前四个系列,整体IC50值在1州以下,其中活性最好的化合物26g对Abl和Aktl激酶的IC50值分别为0.16和0.46μM,比Hit6a的抑酶活性要高约10倍；但甲氧基的引入导致化合物的水溶性较差,我们在对26g进行水溶性改善时设计合成了6位氧上含有丙基吗啉侧链的化合物33a,活性测试结果显示33a对Abl和Aktl激酶的ICs0值分别为0.13和0.28州。丙基吗啉侧链的引入既能提高化合物26g的水溶性,又能使化合物的抑酶活性得到保持,所以化合物33a是一个非常有前景的具有良好水溶性和抗肿瘤活性的Abl和Akt1双靶点抑制剂。结论：本研究基于Abl和Akt1晶体结构及Hit6a与活性位点的结合模式,在实验室前期工作基础上,设计、合成了五个系列共81个基于4-氨基-1-萘酚骨架的Hit6a类似物。通过初步的体外生物活性评价,我们发现了几个具有进一步研究开发价值的化合物,如：化合物26g和33a等,并进一步对其进行了以分子对接为主的构效关系研究,探讨了其与Abl和Akt1靶点的结合模式,为今后新型小分子Abl和Akt1抑制剂的设计、合成奠定了基础。直接以内皮细胞为研究靶标,在对血管内皮细胞增殖与抑制的相关分子的深入了解基础上,采用相应的药物阻断其胞内信号传导通路中的关键蛋白Abl和Akt,抑制血管内皮细胞增殖及肿瘤血管生成的手段,已经证明对肿瘤治疗有十分重要的意义。
【作者】徐福明；
【导师】徐文方；
【作者基本信息】山东大学，药物化学，2014，博士
【关键词】ABL；AKT1；蛋白激酶；人脐静脉内皮细胞；胸主动脉环；血管生成；
【参考文献】
[1]李亮.基于动态贝叶斯网络方法的战场态势重构技术研究[D].南昌航空大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[2]胡钦安.SK-83型数控地震仪及FP-1型车载现场处理系统通过部级鉴定[J].石油地球物理勘探,1985,05:554.
[3]操慧.中国晚报文化研究——作为个案的《北京晚报》文化[D].四川大学,2004.
[4]罗斌.中国农业银行贵州省分行数据中心安全设计与实现[D].四川大学,电子与通信工程,2003,硕士.
[5]杨明全.辽河油田注汽锅炉群气代油评价研究[D].哈尔滨工业大学,供热、供燃气、通风及空调工程,2013,硕士.
[6]白云.城市交通拥堵问题治理研究[D].长安大学,行政管理,2014,硕士.
[7]吕承菲.综合干预措施下耐多药肺结核诊疗服务评价研究[D].山东大学,社会医学与卫生事业管理,2013,硕士.
[8]何曦.傅氏《郘亭知见传本书目》订补之订误[D].河北大学,中国古典文献学,2014,硕士.
[9]赵吉银.中国和平发展背景下的国家形象塑造探析[D].山东师范大学,国际政治,2013,硕士.
[10]杨涛.TOLL样受体4在小鼠肺部衣原体感染过程中作用的研究[D].华中农业大学,微生物学,2014,硕士.
[11]张振华.可编程序控制器第一期培训班结束[J].冶金自动化,1986,04:61.
[12]于山江·玉素浦,艾尼瓦尔·艾山,赵光伟.不同处理方法对新疆小芦苇半干青贮发酵品质及其营养成分的影响[J].饲料工业.2008(09)
[13]贾玉磊.人脂肪干细胞协同颗粒脂肪移植的实验研究[D].河北医科大学,外科学,2014,硕士.
[14]靳华东.中冶北方固定资产管理系统的设计与实现[D].大连理工大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[15]廖世霞.基于碳纳米管催化剂的异丙苯催化氧化性能研究[D].华南理工大学,工业催化,2014,硕士.
[16]范瑞祥,邓才波,徐在德,肖红霞,孙佳.基于RTDS的有源电力滤波器实物控制器闭环仿真技术[J].电力系统自动化,2014,21:104-107.
[17]刘芳羽.肇兴侗族鼓楼的营造技艺与文化价值[D].中国艺术研究院,设计艺术学,2012,硕士.
[18]刘晶晶.农业企业非系统性风险识别、测度与防范研究[D].山东财经大学,会计学,2012,硕士.
[19]张逊.西安市城中村改造后村民收入保障及增长模式研究[D].西安建筑科技大学,工程经济与管理,2013,硕士.
[20]何黎民.头颈三维有限元模型构建及颅脑直接冲击伤致伤机制研究[D].第二军医大学,2004.
[21]周桂林.浅析检察机关的量刑建议权[D].西南交通大学,经济法,2013,硕士.
[22]徐晓烨,许虹波,赵萍,周露莎,汪燕玲,李梅.不同学历护生专业认同和学业自我效能关系的研究[J].护理学杂志,2014,01:61-63.
[23]付聪.我国通用航空市场分析及保障研究[D].南京航空航天大学,交通运输规划与管理,2013,硕士.
[24]吴劲松.构音障碍康复系统的设计及初步临床疗效观察[D].福建中医药大学,针灸推拿学,2014,硕士.
[25]张薇.高校行政办公管理系统的设计与实现[D].吉林大学,软件工程,2013,硕士.
[26]徐扬.电子产品PHM方法开发和验证实验平台研究[D].西安电子科技大学,材料物理与化学,2013,硕士.
[27]吴倩倩.玉环县特色花卉产业发展研究[D].浙江大学,园艺（专业学位）,2013,硕士.
[28]熊刚.钢结构设计规范（GB50017-2003）总体安全度分析[D].重庆大学,结构工程,2003,硕士.
[29]杜朝举.后现代主义思潮对大学生价值观的影响及对策[D].华中师范大学,思想政治教育,2014,硕士.
[30]陆天宇.经胸腔镜胸骨后与三切口食管癌切除术的对比研究[D].吉林大学,临床医学,2013,硕士.
[31]李苗地.聚乙二醇干扰素α-2a联合利巴韦林治疗老年慢性丙型肝炎疗效观察[D].大连医科大学,内科学,2012,硕士.
[32]邓莉雅.公共精神与当代中国民主政治建设[D].华南师范大学,科学社会主义与国际共产主义运动,2004,硕士.
[33]赵倩.山东省统筹城乡低保制度建设研究[D].山东财经大学,社会保障,2014,硕士.
[34]沈维.典型土石道路路堑沟坡系统产流产沙及养分输移特征研究[D].华中农业大学,水土保持与荒漠化防治,2014,硕士.
[35]朱庆芹.一种改进的快速独立分量分析方法在信噪分离中的应用[J].现代制造工程,2015,03:132-135+141.
[36]贺莉.江西省城市湿地公园本土文化特色塑造研究[D].江西农业大学,园林植物与观赏园艺,2012,硕士.
[37]白静.利用ARGO-YBJ实验数据对月亮阴影的研究[D].河北师范大学,理论物理,2013,硕士.
[38]郑玲.高中语文阅读教学中“同课异构”教研活动的个案研究[D].山西师范大学,课程与教学论,2014,硕士.
[39]王翠.A教育集团教师高离职率及对策研究[D].吉林大学,工商管理,2013,硕士.
[40]李大相.对《石油地球物理勘探》的希望[J].石油地球物理勘探,1990,06:647.
[41]秦胜.基于周期事件系统的高速铁路列车运行图编制模型及算法研究[D].北京交通大学,2013.
[42]张学良,潘啸虹.崛起的启示——从浙江义乌市勘察测绘院迅猛发展想到的[J].中国测绘.1996(01)
[43]陈新斌.海水胁迫下菠菜叶片叶黄素循环调控叶绿素代谢的机理研究[D].南京农业大学,蔬菜学,2013,硕士.
[44]吴妍妮.电动多叶光栅控制系统的研究与设计[D].安徽大学,检测技术与自动化装置,2014,硕士.
[45]徐书芝.基于行动导向教学的中职学校教学改革研究[D].河北师范大学,教育管理,2012,硕士.
[46]齐茗.高血压患者脉压指数与冠脉病变程度的相关性研究[D].延安大学,内科学,2014,硕士.
[47]周喻,彭海琳,刘忠范.非对称掺杂双层石墨烯的外延生长及其高效光电转换器件[A].中国化学会.中国化学会第29届学术年会摘要集——第30分会：低维碳材料[C].中国化学会:,2014:1.
[48]王锦源.李日华改本《南西厢记》研究[D].苏州大学,戏剧戏曲学,2014,硕士.
[49]韩东江.高速涡轮轴系稳定性分析与实验研究[D].中国科学院研究生院（工程热物理研究所）,动力机械及工程,2014,博士.
[50]王超.宽范围软开关直流变换器控制方法研究[D].哈尔滨工业大学,电力电子与电力传动,2014,硕士.
